| Start | Informacje | Spis treści | Słownik | Przydatne adresy |

5.3 Transformacja przy pomocy wirusów

Wirusy w biotechnologii roślin wykorzystuje się stosunkowo rzadko, głównie jako wektory do badania przejściowej ekspresji (wywoływanej przez DNA episomalny, czyli nie wbudowujący się do chromosomów komórki-biorcy). Do tego celu nadają się wirusy zawierające dwuniciowy DNA. Jest to dość nietypowa forma wirusowego genomu, ponieważ większość wirusów naturalnie bytujących w roślinach ma genom w formie RNA. Wszystkie jednak wyżej wspomniane poądane cechy wykazuj pararetrowirusy, do których zalicza się najczściej stosowanego w praktyce wirusa mozaiki kalafiora (CaMV). [Pararetrowirusy to grupa wirusów, która powiela swój genom, mający postać dwuniciowego DNA, używając jednej z nici, tworząc na zasadzie replikacji jej komplementarną kopię; następnie ta nowo utworzona nić przeprowadza transkrypcję, po czym transkrypt ulega odwrotnej transkrypcji i w ten sposób odtwarzana jest wyjściowa cząsteczka DNA]. Stosując takie wektory uzyskuje się bardzo wysoki stopień powielenia sekwencji w komórce i silną choć niezbyt trwałą ekspresję (aktywność genu). Maksymalna ekspresja obserwowana jest w ciągu jednego do dwóch tygodni po zakażeniu tkanek. Tego typu transformacja znajduje zwłaszcza zastosowanie do szybkiego wstępnego szacowania wyników transformacji przed uzyskaniem trwałych transformantów jedną z pozostałych metod, wymagających dłuższego czasu.

Jako wektory próbuje się też czasem wykorzystywać geminiwirusy z genomem w formie jednoniciowego DNA oraz RNA-wirusy z nicią infekcyjną plus (nicią plus nazywamy tę cząsteczkę kwasu nukleinowego, która ma sekwencję taką jak transkrypt wykorzystywany do syntezy białek, a nie komplementarną). W praktyce nie wykorzystuje się obecnie wirusów RNA z nicią infekcyjną minus, wirusów RNA "obusensowych" i wirusów zawierających dwuniciowe cząsteczki RNA (ich zastosowanie musiałoby być bardziej pracochłonne i kłopotliwe).

Aby stać się skutecznymi wektorami wirusy muszą wykazywać zdolność do wydajnego zakażania roślin. W naturze wirusy dostają się do komórek roślinnych w sposób mechaniczny (przez uszkodzone tkanki) lub przy pomocy fitopasożytów, zwłaszcza roślinożernych owadów. Ze względu na trudności w kotrolowaniu rozprzestrzeniania się wirusów przenoszonych przez owady, do praktycznych manipulacji bardziej zalecane jest wykorzystywanie tych, które wykorzystują drogę mechaniczną. Wirusy, które tego nie potrafią np. porażające floem luteowirusy i geminiwirusy, można wbudować do T-DNA Agrobacterium i za pomocą tych bakterii wprowadzić do roślin.

Ze względu na to, że wirusy opakowują swój genom białkowym płaszczem, nie można tego genomu do woli powiększać, bo płaszcz może się w końcu okazać za ciasny. Wprowadzenie zbyt dużego insertu zaburza cykl życiowy wirusa i uniemożliwia jego namnażanie się w roślinie. Strategia dodania (insercji) transgenu była jednak wykorzystana przez niektórych badaczy, zwłaszcza w pracach nad wirusami cylindrycznymi (helikalnymi) - TMV, PVX i PVY (wywołującymi – pierwszy –mozaikę tytoniu, a dwa ostatnie – mozaikę ziemniaka). Istnieją następujące alternatywy dla tego podejścia: zamiana fragmentu genomu wirusa i komplementacja.

Zamiana fragmentu genomu polecana jest zwłaszcza w przypadku wirusów kodujących czynniki białkowe odpowiadające za ich przenoszenie przez owady (transgen można wprowadzić w miejsce genu kodującego takie białko). Strategię zamiany genu zastosowano m.in. w przypadku wirusa CaMV, okazało się jednak, że nie naruszając funkcji życiowych wirusa wprowadzić można tylko stosunkowo krótki odcinek DNA, długości ok. 250 pz. U niektórych wirusów wprowadzano transgen w miejsce genu kodującego białko płaszcza.

Strategia komplementacji polega na tym, że transgen wprowadzany jest w miejsce jednego z wirusowych genów, ale aby zapewnić utrzymanie się wirusa w roślinnych komórkach, do transformacji używa się oprócz wirusów "rozbrojonych" przenoszących transgen, także pomocniczych, zawierających wszystkie geny niezbędne dla pełnego cyklu rozwojowego wirusa. Strategia komplementacji może też polegać na tym, że transformacji poddaje się rośliny, które zawierają wprowadzony już wcześniej gen wirusa i w związku z tym wirus pełniący teraz funkcje wektora nie musi już tego genu zawierać.

Odmienny, lecz warty wzmianki nurt badań stanowią prace, w których do roślin wprowadza się wirusy nie w celu transformowania roślin, ale w celu namnożenia wirusów, używanych później do tzw. prezentacji epitopu. W tym przypadku wirusy są zmodyfikowane tak, by mogły pełnić funkcje szczepionek dla ludzi lub zwierząt. Do kapsydów, czyli białkowych płaszczy wirionów (cząstek wirusa), dołączono układy aminokwasów typowe dla patogenów człowieka lub zwierząt, i to w taki sposób, aby wystawały z płaszcza wirusa na zewnątrz. Takie wiriony mogą być łatwo oczyszczane z roślin, a dzięki wystającym z nich epitopom, skutecznie pobudzają reakcje odpornościowe u ludzi i zwierząt. Z drugiej strony, będąc pasożytami roślin, wirusy te nie stwarzają niebezpieczeństwa dla organizmu człowieka czy zwierząt.

Praktyczne wykorzystanie wirusów w biotechnologii roślin napotyka problemy związane z niską wiernością replikaz wirusowych; szybkimi mutacjami genów, a także rekombinacjami i delecjami obcych sekwencji z wirusowych genomów (mechanizm tego zjawiska jest nieznany). Pod tym względem stabilności genetycznej korzystniejsze powinny być wirusy, u których rozmnażanie zachodzi poprzez replikację DNA a nie transkrypcję. W przypadku niektórych wirusów występuje etap proteolitycznej obróbki łańcuchów polipeptydowych (podobnej do składania mRNA u eukariotów), więc insercja transgenu nie gwarantuje jego prawidłowej ekspresji.