| Start | Informacje | Spis treści | Słownik | Przydatne adresy |

5.2 Transformowanie roślin przy pomocy Agrobacterium tumefaciens lub A. rhizogenes

Agrobacterium to rodzaj wolno żyjących, fitopatogenicznych bakterii glebowych, które atakują rośliny wnikając do nich przez zranione tkanki. W przypadku Agrobacterium tumefaciens zakażenie prowadzi do powstawania tumorowatych narośli na szyjce korzeniowej (guzowatość korzeni; ryc. 1), natomiast Agrobacterium rhizogenes wywołuje chorobę objawiającą się powstawaniem w miejscu infekcji obfitej masy tzw. korzeni włośnikowatych. Rodzaj Agrobacterium do którego należą też gatunki niepatogeniczne, zalicza się do rodziny Rhizobiaceae, wraz z licznymi gatunkami bakterii brodawkowych nawiązujących symbiozę z roślinami motylkowatymi.

Transformacja za pośrednictwem Agrobacterium wykorzystuje naturalną zdolność tych bakterii do przekazywania części swojego materiału genetycznego komórkom roślinnym. Tworzenie się korzeni włośnikowatych lub zrakowaceń korzeni jest objawem wbudowania do genomu rośliny-żywiciela odcinka bakteryjnego DNA zwanego T-DNA(z ang. transfer - przeniesienie). T-DNA zanim zostanie przetransportowane do komórki roślinnej wchodzi w skład plazmidu, zwanego Ti w przypadku A. tumefaciens (z ang. tumor inducing), lub Ri - w przypadku A. rhizogenes (ang. root inducing). Ze względu na dość gigantyczny rozmiar - ok. 180 tys. - 400 tys. p.z. (par zasad), zwykle ok. 200 tys. p.z. - zarówno plazmid Ti jak i Ri bywa nazywany megaplazmidem. Wielkie plazmidy występują zwykle w komórce w niewielkiej liczbie kopii. Tak jest też w przypadku megaplazmidów Agrobacterium - liczbę ich cząsteczek w komórce ocenia się jako jedna do dwóch. Różne szczepy A. tumefaciens przenoszą nieco odmienne plazmidy Ti, ale z reguły każdy z nich zawiera jeden region T-DNA, u niektórych jednak szczepów (tzw. oktopinowych) plazmid Ti zawiera dwa odrębne odcinki T-DNA: lewy (T_L-DNA) i prawy (T_R-DNA), albo trzy: lewy, prawy i środkowy (T_C DNA), które niezależnie od siebie wnikają do komórki roślinnej. Zakres odcinka T-DNA plazmidu (lub każdego z odcinków T_L, T_C i T_R) określony jest położeniem tzw. sekwencji granicznych, które mają długość zaledwie ok. 25 p.z. i tworzą niedokładne powtórzenia bezpośrednio przed i tuż za każdym odcinkiem T-DNA (R i L, ryc. 2). Dla ilustracji podajemy te sekwencje z zaznaczeniem dowolności nukleotydów w niektórych pozycjach (N - dowolny nukleotyd, Pu - puryna; ukośnikiem oddzielone alternatywne nukleotydy, lub - w nawiasach - krótkie alternatywne sekwencje):
     R: TGGCAGGATATAT(TG)/(NC)N(PuG)/(CT)TGTAA(AT)/(TC)
     L: TGGCAGGATATATTCGNNG/ATGTAAC/A.
Sekwencje graniczne wraz z T-DNA przenoszone są do komórek roślinnych. Typowy odcinek T-DNA ma wielkość około 20 tys. p.z. i zawiera geny, których działanie w roślinie powoduje charakterystyczne objawy chorobowe - poza wspomnianymi już naroślami i korzeniami włośnikowatymi, należy do nich nagromadzanie się w tkankach porażonej rośliny nietypowych dla zdrowych roślin metabolitów, zwanych opinami (są to pochodne aminokwasów i kwasów karboksylowych; jakkolwiek pod wpływem Agrobacterium wytwarzają je rośliny, dla roślin substancje te są nieprzyswajalne, natomiast stanowią doskonałą pożywkę dla bakterii). Geny wywołujące tworzenie się korzeni włośnikowatych lub zrakowaceń nazywane są onkogenami. Jeśli z plazmidu Ti lub Ri usunie się onkogeny i geny syntezy opin i zastąpi je jakimkolwiek innym DNA (nazwijmy je insertem), to - o ile tylko nie zostaną przy tym uszkodzone sekwencje graniczne - bakteria nie pozna się na podstępie i przekaże ten insert do rośliny, tak jak by to robiła z właściwym T-DNA. Szczególnie ważne jest zachowanie prawej sekwencji granicznej, od której zaczyna się proces przenoszenia fragmentu DNA (wycinania, przypuszczalnie w formie jednoniciowej cząsteczki). Skoro tak zmodyfikowane T-DNA nie zawiera onkogenów, to rośliny do genomu których to DNA zostanie przemycone, nie będą wykazywały objawów chorobowych. Na ogół więc używa się do transformowania roślin specjalnych szczepów Agrobacterium, tzw. rozbrojonych, których megaplazmid pozbawiony jest onkogenów. Geny syntezy opin na ogół są zachowane w rejonie T megaplazmidu i mogą być wykorzystane jako markery (wskaźniki) skutecznej transformacji.

W praktyce nie przeprowadza się ligacji użytkowego genu z bakteryjnym megaplazmidem. Bardzo duże cząsteczki DNA są niewygodne w obróbce - ponieważ występują w komórkach w małej liczbie kopii, więc trudno izolować je w większej ilości; typowe enzymy restrykcyjne tną je na wiele fragmentów, więc trudno wbudować do nich jakąkolwiek wstawkę DNA (insert); problemem byłoby też ponowne wprowadzenie do bakterii zmodyfikowanego megaplazmidu (wydajność transformacji bakterii tak wielkimi cząsteczki DNA jest niska). Na ogół więc transgen wprowadzany jest do Agrobacterium w niewielkim plazmidzie, łatwo poddającym się manipulacjom. Plazmid ten może zawierać obie sekwencje graniczne i pomiędzy nie wklonowuje się transgen czy transgeny. Przy takim podejściu (zwanym systemem binarnym) bakterie wycinają T-DNA bezpośrednio z niewielkiego plazmidu (zwanego plazmidem binarnym) i przekazują go roślinie.

Plazmid binarny można łatwo powielać, izolować i modyfikować nie tylko dlatego że jest mały, ale także dlatego że ma charakter wektora wahadłowego, to znaczy ulega powielaniu w dwóch gatunkach organizmów - w tym przypadku zarówno w bakteriach Agrobacterium jak i Escherichia coli (plazmid ten zawiera więc miejsca ori umożliwiające rozpoczęcie pracy polimerazom DNA obu gatunków bakterii; izolacja DNA i transformacja jest łatwiejsza i wydajniejsza w przypadku E. coli niż Agrobacterium, więc przygotowując konstrukt wykorzystuje się ten pierwszy rodzaj bakterii, a dopiero na końcowym etapie prac wprowadza się go do Agrobacterium).

Szczepy Agrobacterium tumefaciens wykorzystywane w systemie binarnym nadal posiadają megaplazmid, ale nie zawiera on T-DNA, natomiast pełni ważną funkcję pomocniczą (w systemie binarnym megaplazmid nazywany jest też plazmidem pomocniczym) - koduje białka (zwane czynnikami wirulencji), które mają za zadanie

1. rozpoznanie substancji wskazujących na obecność w otoczeniu bakterii uszkodzonych tkanek roślinnych; uaktywnienie syntezy pozostałych czynników wirulencji
2. wytworzenie celulozowych włókien mocujących komórkę bakteryjną do ściany komórki roślinnej
3. wytworzenie kanału (pilusa) umożliwiającego T-DNA pokonanie błony cytoplazmatycznej komórki roślinnej
4. rozpoznanie sekwencji granicznych i wycięcie T-DNA z plazmidu binarnego,
5. opłaszczenie T-DNA, co zabezpieczy je przed rozkładem w cytoplazmie roślinnej komórki i spowoduje przetransportowanie go do jądra komórkowego

W skład megaplazmidu wchodzą też geny umożliwiające bakteriom metabolizowanie opin (geny katabolizmu opin). Właśnie dlatego, że geny te nie są składnikiem T-DNA, ale stanowią osobny obszar megaplazmidu, nie są przekazywane do genomu rośliny i bakteria zachowuje wyłącznie dla siebie informację o tym jak wykorzystywać opiny. Poza systemem binarnym transformacji roślin stosowany jest czasami (lecz dużo rzadziej) system zwany kointegracyjnym. W tym przypadku transgeny przed przeniesieniem do komórek roślinnych wycinane są z bakteryjnego megaplazmidu. Ale i w tym systemie wprowadzaniem transgenów do megaplazmidu nie kłopocze się eksperymentator. Zadanie to zostawia się bakteriom. Podobnie jak w systemie binarnym, do bakterii wprowadzane są transgeny w konstrukcie opartym na niewielkim plazmidzie wahadłowym, ale tym razem nie musi on zawierać lewej i prawej sekwencji granicznej, lecz jakiekolwiek sekwencje, występujące też w plazmidzie Ti. Powoduje to, że w bakteriach dochodzi do wymiany homologicznych odcinków DNA i transgeny ulegają wbudowaniu do plazmidu Ti, czyli kointegracji z nim, a dopiero z tego plazmidu wycinane są i przekazywane do roślin (poza rodzajem plazmidu z którego wycinane jest T-DNA przed przekazaniem go komórce roślinnej, pozostałe elementy mechanizmu transformacji są w obu systemach jednakowe).

W procesie przeniesienia fragmentu DNA do komórki roślinnej za pośrednictwem Agrobacterium można wyróżnić następujące etapy:

1. przygotowanie hodowli Agrobacterium - wprowadzenie odpowiedniego DNA do wektora wahadłowego i transformowanie tym wektorem komórek Agrobacterium; założenie hodowli bakterii na płynnej pożywce
2. inkubacja bakterii z fragmentami roślin poddawanych transformacji (często pochodzącymi z aksenicznych kultur in vitro); można tu wyróżnić etap koinkubacji - roślinne eksplantaty inkubowane są przez kilka minut do kilku godzin w zawiesinie bakterii - i etap kokultury - eksplantaty przeniesione są na agarową pożywkę pobudzającą regenerację roślin i nie hamującą wzrostu Agrobacterium (ryc. 3)
3. regeneracja roślin na pożywce zawierającej czynnik eliminujący Agrobacterium (antybiotyki z grupy penicylin np. karbenicylina i cefalosporyn np. cefotaksim); często pożywka ta zawiera też antybiotyk lub herbicyd pozwalający na wyselekcjonowanie transformantów (pożywka selekcyjna)
4. ukorzenianie transformantów; może wymagać zmiany zestawu fitohormonów (albo ich pominięcia); czasami konieczne jest też obniżenie stężenia czynnika selekcyjnego
5. testy potwierdzające obecność transgenów w zregenerowanych roślinach i całkowite wyeliminowanie Agrobacterium
6. przeniesienie roślin do ziemi, hartowanie; analizy molekularne, fizjologiczno-biochemiczne i genetyczne.

Mechanizm transformacji przy pomocy A. rhizogenes jest taki jak przy użyciu A. tumefaciens. W odróżnieniu jednak od A. tumefaciens, A. rhizogenes wykorzystuje się zwykle w formie szczepów nierozbrojonych (na przykład w celu ułatwienia ukorzeniania roślin, albo pozyskiwania z roślin metabolitów, które intensywnie nagromadzają się w korzeniach).

Warunkiem wykorzystania Agrobacterium do transformowania roślin jest opracowanie skutecznych metod regeneracji roślin z eksplantatów, selekcji transformantów, pobudzenia genów wirulencji u Agrobacterium, eliminowania bakterii z tkanek transformantów (zbyt silne i długotrwałe obrastanie eksplantatów bakteriami prowadzi do zamierania roślinnych komórek). Rośliny mogą być w różnym stopniu wrażliwe na ten sam szczep Agrobacterium, podobnie różne szczepy bakteryjne wykazują zróżnicowaną zdolność do zakażania tego samego gatunku roślin. Szczepy szczególnie wydajne pod tym względem określa się mianem hiperwiruletnych. Należą do nich: A 281 i jego pochodne, EHA 101 i EHA 105. Czas działania bakterii na tkanki roślinne (kokultury, syn. kokultywacji) powinien być dostatecznie długi, aby przekazać T-DNA do możliwie dużej liczby komórek, jednak im dłuższy czas kokultury tym trudniej wyeliminować bakterie z rozwijających się transformantów.

Wprowadzanie genów za pośrednictwem Agrobacterium jest zazwyczaj bardziej precyzyjne w porównaniu z innymi metodami. Zwykle przenoszony jest wyłącznie i w całości dokładnie określony odcinek DNA leżący między dwiema sekwencjami granicznymi. Ponadto przy użyciu Agrobacterium wbudowana jest zazwyczaj tylko jedna kopia lub niewielka liczba kopii transgenu (wbudowanie wielu kopii jest niepożądane, bo może prowadzić do wyciszenia, unieczynnienia transgenu, a czasami także wyciszenia własnych genów rośliny-biorcy, jeśli wykazują znaczną homologię do transgenu).

Do niedawna kłopotliwym ograniczeniem metody transformacji opartej na wykorzystaniu Agrobacterium był rozmiar przenoszonego DNA (20 - 30 tys. p.z.). Otrzymano jednak wektor BIBAC (ang. binary bacterial artificial chromosome), który umożliwia przenoszenie z Agrobacterium do roślin stosunkowo dużych fragmentów DNA (wielkości około 150 tys.p.z.). BIBAC ma cechy sztucznego chromosomu bakteryjnego, a zarazem wektora binarnego, przez co wydaje się bardzo atrakcyjnym (choć rzadko jeszcze wykorzystywanym) narzędziem do inżynierii genetycznej roślin, a zwłaszcza przenoszenia całych szlaków metabolicznych, modyfikowania właściwości uwarunkowanych poligenowo i mających charakter ilościowy.

Uważa się, że transformacja roślin za pomocą Agrobacterium jest techniką stosunkowo skuteczną, a przy tym w miarę prostą i nie wymagającą wysokich nakładów. Wydajność metody próbuje się czasem jeszcze zwiększać łącząc koinkubację z sonikacją (działaniem ultradźwiękami na eksplantaty w zawiesinie Agrobacterium; zwykle sonikacja jest znacznie krótsza niż koinkubacja i trwa zaledwie parę sekund; w ten sposób ułatwia się bakteriom dostęp do powierzchni roślinnych komórek, nie powodując zbytnich uszkodzeń tkanki). Czasami w transformacji roślin przez Agrobacterium wykorzystuje się infiltrację próżniową (rośliny lub eksplantaty zanurzone w zawiesinie Agrobacterium umieszczane są w atmosferze o znacznie obniżonym ciśnieniu, co powoduje wyssanie powietrza z przestworów międzykomórkowych i ułatwia wnikanie bakterii do tkanek). Podjęto również próbę połączenia transformacji za pomocą Agrobacterium i transformacji biolistycznej (p. niżej).

Wykazano, że Agrobacterium może przekazywać transgeny różnym roślinom - od glonów po jednoliścienne. Wielokrotnie jednak stwierdzano, że w odniesieniu do roślin jednoliściennych metoda jest mało skuteczna, ponieważ nie są to naturalni żywiciele Agrobacterium. Przyczyną tych trudności może być brak lub niedostateczne stężenie metabolitów pobudzających wirulencję bakterii, a wydzielanych przez skaleczone tkanki roślin dwuliściennych. Nowsze doniesienia wskazują, że w odpowiednich warunkach transformacja za pomocą Agrobacterium jest możliwa również w przypadku niektórych gatunków roślin jednoliściennych (w pracach tych wykorzystywano wspomniane wyżej szczepy hiperwirulentne Agrobacterium, u których geny wirulencji stale są aktywne i nie wymagają egzogennych induktorów; podwyższano także skuteczność transformacji roślin przez Agrobacterium podając induktor genów vir; za substancję szczególnie skuteczną pod tym względem uważa się związek fenolowy - acetylosyringon).

Ograniczeniem w stosowaniu transformacji przy pomocy Agrobacterium może być dostępność metod regeneracji roślin in vitro z eksplantatów poddanych działaniu bakterii. Niektórzy badacze próbują ominąć tę trudność wprowadzając Agrobacterium bezpośrednio na rośliny uprawiane ex vitro (transformacja in planta; na przykład w zawiesinie Agrobacterium moczono pąki wegetatywne lub kwiatowe roślin).