| Start | Informacje | Spis treści | Słownik | Przydatne adresy |
| 4.1 Izolowanie protoplastów |
W płynnej pożywce protoplasty mogą spontanicznie łączyć się, zlewając się jakby ze sobą. Zjawisko to zachodzi jednak dość trudno, bo błona cytoplazmatyczna komórek zawiera różnego rodzaju kwasy tłuszczowe, które ze względu na obecność grup COO- nadają błonie ładunek ujemny. Tę niechęć protoplastów do wchodzenia we wzajemne kontakty można neutralizować przy pomocy czynników pobudzających fuzję protoplastów, zwanych fuzogenami.
Można wyróżnić następujące ich rodzaje:
Spośród powyższych fuzogenów czy środków pobudzających fuzjonowanie protoplastów, dwa ostatnie znajdują zastosowanie nieporównanie rzadziej niż metody 1- 2. Fuzogeny powodują przejściowe powstawanie uszkodzeń błony komórkowej, a to ułatwia połączenie się cytoplazmy różnych komórek. Działanie fuzogenami chemicznymi może odbywać się w niewielkiej objętości zawiesiny w zagłębieniu plastykowej mikropłytki (metoda "mikro"), albo w nieco większej objętości, w probówce wirowniczej (metoda "makro"). W metodzie "mikro" protoplasty obu linii komórkowych miesza się delikatnie po czym dodaje się do nich roztwór fuzogena i inkubuje w nim przez około 10 minut. Po tym czasie (w którym nie tylko następuje fuzja, ale też protoplasty opadają na dno komory) pipetą usuwa się ostrożnie większą część roztworu (zawierającego fuzogen) i zastępuje się go roztworem płuczącym. Płukanie powtarzane jest dwukrotnie, po czym roztwór płuczący zastępowany jest pożywką. W metodzie "makro" zawiesiny protoplastów łączy się w probówkach wirowniczych, dodaje do nich fuzogenu i poddaje łagodnemu wirowaniu. Wirowanie przydaje się również do przepłukania produktów fuzji, dokładnego usunięcia fuzogenu i zastąpienia go pożywką.
Nie ma ograniczeń związanych z ewolucyjną odległością łączonych w ten sposób komórek. Na przykład uzyskiwano fuzje pomiędzy protoplastami roślinnymi, a komórkami ludzkimi. W praktyce jednak, jeśli różnica pomiędzy łączonymi komórkami jest większa niż różnica gatunków czy rodzajów, to produkt fuzji nie przechodzi podziałów komórkowych, albo po kilku podziałach zamiera. Do ciekawszych roślin otrzymanych tym sposobem należą mieszańce ziemniak + pomidor nazywane po angielsku topato i pomato (przypominamy, że gdy mowa o mieszańcach somatycznych, formy rodzicielskie łączymy znakiem +, a nie symbolem mnożenia x, jak w przypadku "zwykłych" czyli generatywnych mieszańców).
Częstość zlewania się protoplastów przy stosowaniu fuzogenów wynosi 1-20% , a wśród produktów fuzji tylko niewielką część (np. około 10%) stanowią pożądane kombinacje. Oznacza to zwykle przede wszystkim heterokariocyty (= heterokariony), czyli produkty połączenia dwóch protoplastów różnych genetycznie (na przykład pomidor + ziemniak, w przeciwieństwie do homokariocytów, tj. komórek powstałych z połączenia dwóch protoplastów o tym samym genotypie, np. ziemniak + ziemniak). Heterokariocyty można czasami rozpoznać na podstawie ich wyglądu. Jeśli jedna populacja poddawanych fuzjonowaniu protoplastów powstała z drobnych, zielonych komórek miękiszu asymilacyjnego, a druga z większych, bezbarwnych komórek kalusa (hodowanego w ciemności), to jako heterokariocyty można będzie rozpoznawać komórki duże, zawierające jednak wyraźne, zielone, skupiska chloroplastów. Selekcję wzrokową heterokariocytów można ułatwić sobie, barwiąc przyżyciowo obie populacje fuzjonowanych protoplastów różnymi barwnikami fluorescencyjnymi. Na przykład jedna populacja protoplastów barwiona jest FDA (dwuoctanem fluoresceiny) dającym w nadfiolecie żółtozieloną fluorescencję, a druga izoticoyjanianem rodaminy B, dającym czerwoną fluorescencję. Ostatecznie w mikroskopie fluorescencyjnym wyszukuje się protoplasty, które silnie świecą światłem jednej barwy, ale zawierają też obszar świecący w drugim kolorze. W niektórych przypadkach stosowano selekcję heterokariocytów opartą na ich odporności na antybiotyki (każda linia rodzicielska odporna jest na inny antybiotyk, a heterokariocyty odporne są na oba antybiotyki).
Jeśli protoplasty otrzymano z komórek somatycznych, to wynikiem ich fuzji jest powstanie mieszańców somatycznych. Wyróżnia się następujące ich rodzaje:
Wykorzystując cytoplasty można atrakcyjnej odmianie roślin nadać dodatkową właściwość, zakodowaną w genomie cytoplazmatycznym, nie naruszając struktury jej genomu jądrowego. Na przykład hodowcy często zainteresowani są wprowadzeniem do cennej linii hodowlanej cechy męskiej sterylności (niepłodności pyłku; rośliny takie mogą być łatwo wykorzystane do krzyżowań jako żeńskie linie rodzicielskie; można być pewnym, że nie dojdzie u nich do samozapylenia i nie ma potrzeby pracochłonnego usuwania wszystkich pylników z kwiatów). Cecha męskiej sterylności jest kodowana w genomie cytoplazmatycznym, a dokładniej mitochondrialnym. Wystarczy więc fuzjonować protoplasty wybranej cennej linii hodowlanej z cytoplastami roślin męskosterylnych by przenieść cechę cytoplazmatycznej męskiej sterylności, nie zmieniając przy tym wielu innych ważnych właściwości rośliny, zakodowanych w genomie jądrowym. Otrzymywanie cybryd zawierających pojedynczy genom jądrowy i pojedynczy genom cytoplazmatyczny (cybrydy typu "b" w powyższym opisie) ułatwia też selekcję komórek mieszańcowych. W cybrydach następuje komplementacja (uzupełnianie się, współdziałanie) genomów i dzięki temu mogą one stosunkowo szybko odtwarzać ścianę komórkową i dzielić się. Natomiast inne protoplasty występujące w takim doświadczeniu albo nie są w stanie dzielić się, ze względu na brak genomu jądrowego, albo przechodzą podziały bardzo opóźnione, ze względu na przejściowe unieczynnienie genomu cytoplazmatycznego.
Somatyczne mieszańce otrzymywano stosunkowo często u roślin z rodzin Solanaceae, Brassicaceae, Fabaceae, Poaceae. Uzyskane w ten sposób mieszańce mogą być płodne (zwykle w przypadku krzyżowania blisko spokrewnionych gatunków) lub bezpłodne. W niektórych przypadkach udawało się przywrócić im płodność podwajając ich genom (w wyniku kolchicynowania).
Otrzymanie mieszańca somatycznego jest wstępem do prac hodowlanych, w których nowo wprowadzone cechy użytkowe "komponowane" są z innymi właściwościami roślin; np. po wprowadzeniu odporności na patogeny należy zoptymalizować właściwości smakowe, wartość odżywczą, plenność itp. (jeśli mieszaniec jest płodny to dalsze prace mogą być prowadzone metodami klasycznej hodowli).
Jeśli celem prac jest otrzymanie nie formy pośredniej, wykazującej mniej więcej w tym samym stopniu cechy obu rodziców, ale otrzymanie formy zbliżonej do jednego z rodziców pod względem większości cech, a po drugim rodzicu dziedziczącej tylko jedną czy kilka właściwości, to otrzymany mieszaniec powinien być przez wiele następnych pokoleń krzyżowany z rodzicem, którego właściwości mają w pożądanych roślinach dominować (krzyżowanie wypierające).
| 5.1 Zasady i cele transformacji genetycznej |