| Start | Informacje | Spis treści | Słownik | Przydatne adresy |

4.1 Izolowanie protoplastów

Protoplast obejmuje wszystkie składniki komórki roślinnej lub drobnoustroju oprócz ściany komórkowej. Otoczony jest więc tylko białkowo-lipidową błoną cytoplazmatyczną. Skrótowo możemy to przedstawić równaniem: protoplast = komórka - ściana komórkowa.

Trzymając się tej algebraicznej konwencji, przypomnijmy też, że:

Komórki roślinne występujące w organach i tkankach mają zwykle kształt wielościanów, będący wynikiem działania turgoru, wytrzymałości ścian komórkowych i naporu sąsiednich komórek. W zawiesinie natomiast pojedyncze komórki przyjmują często kształt owalny czy rogalikowaty, wynikający ze zróżnicowanej elastyczności różnych obszarów ściany komórkowej. Izolowane protoplasty z kolei mają kształt niemal idealnie kulisty. Kulisty kształt przyjmują komórki jeszcze zanim ich ściany zostaną całkowicie usunięte. Takie komórki, kuliste lecz nie w pełni pozbawione ściany komórkowej nazywa się sferoplastami. Od izolowanych protoplastów można je odróżnić stosując obserwacje mikroskopowe uwidaczniające celulozę, np. w mikroskopie fluorescencyjnym widać wzbudzaną światłem nadfioletowym niebieską fluorescencję celulozy. Oczywiście, widać ją w przypadku sferoplastów, ale nie właściwych protoplastów, które celulozy zupełnie już nie zawierają.

Podczas izolowania protoplastów w znacznym stopniu zanika stan strukturalnego i fizjologicznego spolaryzowania (zróżnicowania, biegunowości) komórek. Izolowane protoplasty stanowią niezwykle jednorodny zbiór pojedynczych komórek (ścianę komórkową są w stanie w krótkim czasie odbudować), a dzięki temu są doskonałym materiałem do analizowania zdolności rozwojowych komórek. Ponieważ plazmodesmy, łączące sąsiednie komórki, podczas izolacji protoplastów ulegają zerwaniu, izolowane protoplasty znajdują zastosowanie do badania zakażeń wirusami w ściśle kontrolowanych warunkach (w bardziej złożonych układach doświadczalnych plazmodesmy ułatwiają wirusom rozprzestrzenianie się w tkance, a ponieważ rozmieszczenie plazmodesm trudno jest dokładnie prześledzić, pojawiają się trudności w zapewnieniu kotrolowanych warunków i powtarzalności doświadczeń). Dzięki zastosowaniu izolowanych protoplastów uzyskuje się większą częstość zakażeń i ich częściową synchronizację. Protoplasty są też doskonałym materiałem do prac z zakresu indukowanej mutagenezy, bo badaczowi bardzo zależy w tych doświadczeniach na wyselekcjonowaniu klonów komórek różniących się genotypem, a te najłatwiej znaleźć wśród komórek maksymalnie zbliżonych pod względem fizjologicznym. Zastosowanie protoplastów pozwala też na ograniczenie ryzyka regenerowania roślin mozaikowych (chimer), jakie powstają gdy jedną roślinę współtworzą komórki o różnym genotypie (np. gdy zawiązek pędu powstaje ze skupiska zawierającego zarówno komórki zmutowane jak i dzikiego typu). Dzięki odsłonięciu błony cytoplazmatycznej izolowane protoplasty świetnie nadają się do badania budowy tej ważnej komórkowej struktury, a także do badania mechanizmów odtwarzania ściany komórkowej. Usunięcie ściany komórkowej ułatwia izolowanie delikatnych składników komórek, na przykład wielkoczasteczkowego DNA, a z drugiej strony pozwala na wprowadzanie do komórki obcych elementów, na przykład cząsteczek DNA, białek, albo całych organelli. Zwłaszcza do wprowadzania obcego DNA protoplasty wykorzystywane są dość często. Możliwe jest też pobudzanie łączenia się (zlewania) dwóch lub więcej protoplastów. Proces ten, zwany fuzjonowaniem protoplastów prowadzi do powstawania komórek mieszańcowych, a można go uzyskać posługując się zarówno protoplastami komórek rozrodczych (generatywnych), jak i somatycznych. Fuzjonowanie protoplastów komórek generatywnych jest jedną z dróg pokonywania barier krzyżowalności roślin, jakkolwiek metodą dość skomplikowaną i kosztowną więc stosowaną niezbyt często. Z protoplastów komórek somatycznych, w wyniku ich łączenia, uzyskuje się mieszańce zwane somatycznymi, albo - tę nazwę stosuje się znacznie rzadziej - paraseksualnymi. Fuzjonowanie protoplastów komórek somatycznych bywa też nazywane somatyczną hybrydyzacją.

Aby otrzymać izolowane protoplasty wystarczy pozbawić komórki ich celulozowo - pektynowych ścian. W najwcześniejszym okresie rozwoju roślinnych kultur in vitro podejmowano próby mechanicznej izolacji protoplastów - tkankę poddawano plazmolizie, a następnie rozdrabniano przy pomocy skalpela lub igieł preparacyjnych, obserwując ją pod mikroskopem. Można było w ten sposób uzyskać pojedyncze izolowane protoplasty, ale wydajność metody była bardzo niska, a ilość uszkadzanych protoplastów bardzo wysoka, stąd obecnie izolacja mechaniczna stosowana jest zupełnie sporadycznie, natomiast w praktyce protoplasty izoluje się niemal wyłącznie metodą enzymatyczną (opisaną przez Cockinga w 1960 r). W tym celu inkubuje się tkankę roślinną (albo komórki z hodowli zawiesinowej) w roztworze zawierającym enzymy celulolityczne (celulaza, drizelaza) i pektynolityczne (macerozym, maceraza, pektoliaza itp. - różni producenci stosują własne nazwy preparatów enzymatycznych), a także sole mineralne i substancje służące jako regulatory osmotyczne, takie jak mannitol, sorbitol, glukoza, sacharoza (stęż. 0,3 - 0,7 M, potencjał osmotyczny około -1700 kPa do -700kPa). Dzięki obecności regulatorów potencjału osmotycznego, komórki podczas izolacji protoplastów utrzymywane są w stanie plazmolizy, co zmniejsza wrażliwość protoplastów na uszkodzenia. Protoplasty mogą być uszkadzane przez enzymy towarzyszące celulazom czy pektynazom jako ich zanieczyszczenia (enzymy te izolowane są zwykle z kultur grzybów). Takimi szkodliwymi domieszkami mogą być proteazy. Dlatego czasami mieszaniny do izolacji protoplastów zawierają jakieś białko, zwłaszcza albuminę wołową, która współzawodniczy o miejsca aktywne proteaz z białkami błon komórkowych i w ten sposób chroni te białka przed uszkodzeniem. Ponieważ izolacja protoplastów stanowi dla komórek stres, czasami dodaje się do roztworu izolacyjnego przeciwutleniaczy, które zapobiegają nagromadzaniu się aktywnych form tlenu i wywoływaniu w protoplastach zaprogramowanej śmierci. Takim przeciwutleniaczem jest zwykle ditiotreitol. Nierzadko jednak enzymy rozpuszczone są w bardzo prostej pożywce, takiej jak CPW (tabela), uzupełniona 9% mannitolem. Wśród składników mineralnych takich roztworów za szczególnie istotne i charakterystyczne uważa się sole wapnia, ponieważ jony wapnia zwiększają stabilność błon i żywotność protoplastów, a także ułatwiają regenerację ściany komórkowej (w niektórych więc procedurach zamiast pożywki CPW z mannitolem do rozpuszczania enzymów trawiących ściany komórkowe używa się roztworu samego chlorku wapnia z jakimś regulatorem osmotycznym, np. mannitolem). Z drugiej strony roztwory stosowane do izolowania protoplastów z reguły nie zawierają jonów amonowych, ponieważ jony te obniżają przeżywalność protoplastów.

Ważnym czynnikiem wpływającym na wydajność izolacji jest proporcja masy tkanki do objętości mieszaniny trawiącej i stężeń enzymów w mieszaninie. Zwykle 1 g świeżej masy tkanki poddaje się trawieniu w objętości ok. 10 ml roztworu, w którym poszczególne enzymy mają stężenia od ok. 0,5% do 2%. Na ogół enzymy rozpuszczają się dość trudno, więc roztwór trzeba mieszać długo (na przykład dwie godziny) lecz bardzo łagodnie (żeby zapobiec denaturacji enzymów). Odkażanie roztworu enzymatycznego musi oczywiście być przeprowadzone przez filtrację, czasami poprzedza się ją jednak wirowaniem, żeby usunąć nierozpuszczone cząstki białka, które mogłyby łatwo zakleić filtr do odkażania. Materiałem biologicznym wykorzystywanym jako źródło protoplastów może być zawiesina komórkowa, kalus, lub różne fragmenty roślin, zwykle jednak zaleca się, aby był to materiał pochodzący już z hodowli in vitro, tak aby bezpośrednio przed izolacją protoplastów nie trzeba było przeprowadzać odkażania. Korzystny wpływ na wydajność izolacji i zdolności regeneracyjne protoplastów może wywierać etiolacja materiału roślinnego (zmiany fizjologiczne i strukturalne wywołane uprawą w ciemności, na przykład przez dwa tygodnie). W przypadku użycia większych fragmentów tkanki, kroi się je skalpelem na paski o szerokości poniżej 1 mm, co ułatwia dostęp enzymów. Jeśli materiał stanowią liście, można spróbować usunąć epidermę odrywając ją pincetą (nie u wszystkich gatunków jest to łatwe), albo pocierając powierzchnię liścia szczoteczką do rąk, i odsłaniając w ten sposób komórki miękiszu, będące znacznie lepszym niż epiderma źródłem protoplastów, ponieważ miękisz dużo łatwiej ulega maceracji. Izolowanie protoplastów komórek epidermalnych, jakkolwiek nieco mniej wydajne, jest jednak możliwe i stosowane np. do badania fizjologii komórek szparkowych. Etap trawienia enzymatycznego ścian komórkowych może być poprzedzony tzw. preplazmolizą (wstępną plazmolizą), podczas której, materiał biologiczny jest inkubowany (na przykład przez godzinę) w roztworze, który nie zawiera enzymów, ale zawiera wszystkie pozostałe składniki mieszaniny trawiącej (czynnik buforujący, substancję osmotycznie czynną itp). Po wymianie roztworu do preplazmolizy na mieszaninę enzymatyczną zaczyna się właściwa izolacja protoplastów, którą zwykle przeprowadza się w płytce Petriego, łagodnie kołysanej (z szybkością ok. 20 - 100 obr/min, zależnie od gatunku rośliny), na świetle lub w ciemności, przez okres od kilku do kilkudziesięciu godzin, zależnie od wymagań użytego obiektu biologicznego. Wydajność enzymatycznej izolacji protoplastów jest wysoka i wynosi 100 tys. do kilkudziesięciu milionów protoplastów z 1 g tkanki.

Izolowane protoplasty powinny być oddzielone od pozostałości niestrawionej tkanki i szczątków uszkodzonych komórek. Zgrubnie można w tym celu zastosować sączenie przez sitka o znanej porowatości (powyżej 200 μm dla usunięcia dużych fragmentów tkanki, około 50 μm dla oddzielenia komórek i protoplastów od szczątków uszkodzonych komórek i in. drobnych zanieczyszczeń). Do oczyszczania protoplastów stosuje się też często wirowanie. Protoplasty zawieszone są w odpowiednio gęstej pożywce (np. zawierającej dużo sacharozy - ok. 100 g/l) i podczas wirowania pływają w górnej warstwie pożywki, podczas gdy komórki zawierające ścianę komórkową, opadają na dno. Takie przemywanie protoplastów nazywane jest flotacją (podobnie jak każdy inny proces oczyszczania nierozpuszczalnych substancji na podstawie ich zróżnicowanej zdolności do pływania na powierzchni jakiegoś płynu).

Jakość izolowanych protoplastów, ich żywotność, można badać metodami, które przedstawimy dokładniej przy omawianiu hodowli komórkowych (Rozdział 6.5), tj. przy pomocy błękitu Evansa (uwidaczniającego komórki z uszkodzonymi błonami) lub dwuoctanu fluoresceiny (mierzącej aktywność esteraz).

W początkowym okresie (przed regeneracją ściany komórkowej) protoplasty mają duże wymagania pokarmowe i łatwo tracą metabolity, dlatego hodowle prowadzone są w małej objętości płynnej pożywki (tworzącej kilkumilimetrową warstwę, albo krople "siedzące" na dnie szalki, ewentualnie krople "wiszące" na wieczku szalki) albo w cienkiej warstwie miękkiego agaru na płytkach Petriego. Opisano też układ hodowli w agarozowych kulkach. W tym przypadku zawiesina protoplastów mieszana jest z roztworem agarozy, ochłodzonej do 36°C, a następnie pipetowana drobnymi kroplami na dno płytki Petriego. Gdy agaroza się zestali, agarozowe kulki zalewane są niewielką ilością płynnej pożywki.

Do hodowli protoplastów znajduje zastosowanie pożywka Murashigego-Skooga, czasami zmodyfikowana, a często także, znacznie od niej bogatsza, pożywka Kao Michayluka.
Można też wykorzystywać pożywkę przystosowawczą (tj. kondycjonowaną, czyli "oswojoną" przez hodowanie na niej przez krótki czas innej, szybko rosnącej kultury). Możliwe jest też naniesienie zawiesiny protoplastów na błonę stykającą się z szybko rosnącą kulturą tkankową (zwłaszcza kalusem). Taka błona pozwala na przenikanie aminokwasów i witamin z kultury tkankowej do zawiesiny protoplastów, ale pozwala jednocześnie na dokładne oddzielenie tej kultury od mikrokalusów powstających z protoplastów. Pożywka ma podwyższony potencjał osmotyczny, dzięki czemu plazmoliza cofa się.

Pierwszym wynikiem hodowli protoplastów jest regeneracja ściany komórkowej, obserwowana po kilku dniach, później następuje wznowienie podziałów i w niektórych przypadkach (nadal dość nielicznych) - regeneracja roślin. Znacznie trudniejsze do pobudzenia są podziały komórek zregenerowanych z protoplastów roślin jednoliściennych niż dwuliściennych. Stosunkowo łatwo jest pobudzić protoplasty do regenerowania roślin u mszaków. Drobne kolonie otrzymane z protoplastów nazywamy protoklonami lub mikrokalusami. Wydajność wysiewu protoplastów (częstość tworzenia przez nie mikrokalusów) waha się w opublikowanych procedurach, zależnie od rośliny i metody, w zakresie 0,1% do 80%. Rośliny regenerowane z jednego kalusa powinny stanowić klon, a więc wykazywać identyczny genotyp. Dosyć często jednak obserwuje się zmienność somaklonalną, która w tym typie hodowli bywa też nazywana zmiennością protoklonalną.