| Start | Informacje | Spis treści | Słownik | Przydatne adresy |

3.1 Zastosowanie kultur in vitro do otrzymywania mieszańców generatywnych. Zapylenie in vitro i ratowanie zarodków

Zapylenie in vitro jest szczególną formą sztucznego (kontrolowanego) zapylenia roślin, które praktykowano już od paru tysięcy lat, jako sposób na zwiększanie plonów roślin (zwiększanie częstości zapylenia, częściowe uniezależnienie plonowania od pogody i oblotu owadów zapylaczy), a także na otrzymywanie pożądanych form roślin, a więc jako element intuicyjnej początkowo hodowli (krzyżowanie różnych form, albo przeciwnie - wymuszanie samozapylenia).

Sztuczne zapylenie w najprostszej postaci polega na tym, że rozchyla się płatki korony nie rozwiniętych jeszcze kwiatów, odcina pylniki aby zapobiec samozapyleniu (zabieg określany terminem kastracja), po czym związuje się płatki korony, albo zakłada się na kwiaty izolatory w postaci papierowych lub foliowych torebek, uniemożliwiających przypadkowe zapylenie pyłkiem innych kwiatów tej samej rośliny lub pobliskich roślin. Po 1 - 2 dniach, w czasie kiedy kwiat osiąga pełnię kwitnienia, na znamię słupka nanosi się pyłek odpowiednio dobranej rośliny, za pomocą pędzelka albo dotykając bezpośrednio słupka pylnikiem. W przypadku wymuszonego samozapylenia otrzymuje się rośliny o mniej zmiennym genotypie, w kolejnych pokoleniach coraz wierniej przekazujące potomstwu swoje właściwości biologiczne i uprawowe. Powtarzanie samozapylenia w kilku (około ośmiu) kolejnych pokoleniach roślin prowadzi do otrzymania czystych linii. Czysta linia roślin to potomstwo wysoce homozygotycznej rośliny poddanej samozapyleniu; tworzą ją więc osobniki o tym samym genotypie, wiernie przekazujące swój genotyp następnym pokoleniom. U roślin stanowiących czyste linie, fenotyp jest silnie powiązany z genotypem (nie ma efektu maskowania recesywnych alleli przez ich dominujące odpowiedniki). Łatwiej też przewidywać wynik krzyżowania dwóch (różnych) czystych linii w porównaniu z krzyżowaniem roślin w znacznym stopniu heterozygotycznych. Z obu tych powodów hodowcy chętnie wykorzystują czyste linie w pracach nad nowymi odmianami.

Zazwyczaj krzyżowane rośliny należą do tego samego gatunku. Krzyżowanie międzygatunkowe lub międzyrodzajowe, zwane krzyżowaniem form oddalonych jest dużo trudniejsze. Czasami zachodzi wprawdzie spontanicznie, lecz zdarza się to bardzo rzadko (choć częściej niż u zwierząt). Hodowcy wykorzystują takie spontaniczne mieszańce, potrafią je też sztucznie otrzymywać. Celem krzyżowania form oddalonych może być nadanie roślinom uprawnym jakiejś użytecznej cechy, właściwej ich dzikim krewniakom, np. odporności na patogeny i stresy abiotyczne (np. susza, chłód), czy korzystnego pokroju. W takich pracach zakłada się, że pożądana roślina powinna odziedziczyć zdecydowaną większość cech po jednym z rodziców (gatunku uprawnym), a tylko jedną lub kilka cech przejąć od drugiego rodzica (dzikiej rośliny). W tym celu potomstwo z krzyżowania oddalonego jest wielokrotnie krzyżowane z formą uprawną - biorcą kilku genów formy dzikiej. Zabieg ten nazywa się krzyżowaniem wstecznym lub backcrossem. W wyniku wielokrotnego krzyżowania wstecznego następuje stopniowe wypieranie genów jednego z rodziców. Oczywiście dobierając rośliny do kolejnego krzyżowania wstecznego, trzeba upewnić się, że nadal zawierają te nieliczne, interesujące hodowcę geny formy dzikiej, a nie utraciły ich w wyniku rekombinacji i losowego doboru gamet. Czasami pierwotny produkt krzyżowania oddalonego wykazuje cechy pośrednie, odbiegające wyraźnie od właściwości obu rodziców, lecz z praktycznego punktu widzenia atrakcyjne. W takim przypadku otrzymana roślina może być wprowadzona do uprawy jako nowy, syntetyczny gatunek. Najbardziej znanym przykładem rośliny uprawnej stanowiącej syntetyczny gatunek jest pszenżyto. Mieszańcami form oddalonych są też m.in.: bratek ogrodowy, goździk szklarniowy, petunia, begonia bulwiasta i in. Mieszańcowy charakter tych roślin może być zaznaczony w ich nazwie naukowej, przez włączenie do niej członu "x hybrida" (np. "Petunia x hybrida") lub podanie nazw obu form wyjściowych, połączonych znakiem mnożenia - np. bratek ogrodowy to Viola tricolor x V. lutea. Dodajmy od razu, że spotyka się także zapis, w którym nazwy gatunkowe dwóch rodziców mieszańca połączone są znakiem dodawania, a nie mnożenia. Oznacza to, że roślina nie jest mieszańcem generatywnym (otrzymanym w wyniku zapylenia i zapłodnienia), ale somatycznym - otrzymanym w wyniku sztucznie indukowanego zlania się komórek somatycznych. O mieszańcach somatycznych więcej danych przedstawia Rozdział 4.

Celem krzyżowania form oddalonych może być odtworzenie drogi powstawania jakiejś rośliny uprawnej. Chodzi tu o sprawdzenie hipotezy, że przodkami danego gatunku uprawnego były określone dziko żyjące gatunki. W ten sposób wykazano doświadczalnie, że rzepak (Brassica napus) rozwinął się najprawdopodobniej jako mieszaniec kapusty polnej (inaczej rzepiku) i kapusty warzywnej (czyli jest mieszańcem Brassica rapa x B. oleracea). Oczywiście, obecnie próby krzyżowania form oddalonych odgrywają w takich badaniach rolę pomocniczą, a pierwszorzędne znaczenie mają analizy markerów molekularnych u hipotetycznych form wyjściowych i rośliny, której filogeneza jest odtwarzana. Resyntetyza gatunków przyczynia się do wyjaśnienia ciekawych kwestii poznawczych, a ponadto może dostarczyć form roślin stanowiących cenny materiał wyjściowy do hodowli nowych odmian uprawnych. Czasami łatwiej jest wprowadzić obcy gen do jednego z dzikich rodziców, a potem odtworzyć roślinę uprawną, raczej niż wprowadzać użyteczny gen bezpośrednio do rośliny uprawnej.

Nie zawsze sztuczne zapylenie kończy się powodzeniem, tj. wytworzeniem nasion, a z nich odpowiednich roślin potomnych. Przyczyną trudności w krzyżowaniu roślin mogą być zbyt duże różnice genetyczne pomiędzy obydwoma rodzicami (np. przy krzyżowaniu międzygatunkowym albo międzyrodzajowym, bardziej egzotycznym układom kojarzenia raczej nie daje się żadnych szans) albo zbyt małe różnice u roślin obcopylnych. Ich powstawaniu przeciwdziałają bariery krzyżowalności. Przyjęło się dzielić je na dwie kategorie: przedzygotyczne (lub przedzapłodnieniowe) - tj. te, które zapobiegają powstaniu zygoty, czyli uniemożliwiają zapłodnienie komórki jajowej oraz pozygotyczne (pozapłodnieniowe) - które nie utrudniają wprawdzie zapłodnienia, ale przejawiają swoje istnienie zaburzeniami w rozwoju zygoty, albo niepłodnością mieszańców (czasami pierwsze pokolenie mieszańców jest płodne, ale w dalszych pokoleniach występuje bezpłodność). W warunkach naturalnych bariery przedzygotyczne mogą polegać na izolacji geograficznej (gatunki nie krzyżują się w naturze, gdyż występują w różnych rejonach geograficznych) lub biotopowej (rośliny mogą wprawdzie występować na tym samym obszarze geograficznym, ale nie dochodzi do ich kontaktu bo zajmują różne typy siedlisk), czasowej (pory roku lub pory dnia, np. gdy u dwóch gatunków kwiaty otwierają się o różnych porach doby), lub etologicznej (izolacja gatunków związana z zachowaniem owadów zapylaczy, z ich wiernością w stosunku do niektórych gatunków roślin; np. olejki eteryczne niektórych kwiatów zawierają substancje o aktywności owadzich feromonów; ubarwienie korony kwiatów, obecność i odpowiedni układ włosków, mogą upodabniać kwiaty - zwłaszcza storczyków - do samic owadów zapylaczy, co skłania samce do prób kopulacji i prowadzi do zapylenia kwiatów; tego typu wybiórcze oddziaływania mogą powodować że kwiaty jednego gatunku rośliny zapylane są przez jeden gatunek owadów). Oczywiście przy sztucznym zapyleniu powyższe bariery nie mają żadnego znaczenia, natomiast pewne trudności może stwarzać izolacja mechaniczna (związana z budową kwiatów, zwłaszcza gdy za długa szyjka słupka uniemożliwia łagiewkom pyłkowym dotarcie do zalążków) lub fizjologiczna (zwana barierą sterylności, polegająca na tym że pyłek na znamieniu obcego słupka nie tworzy łagiewki pyłkowej, albo łagiewka zamiera, albo nie jest w stanie dotrzeć do komórki jajowej). Barierę fizjologiczną, utrudniającą krzyżowanie form oddalonych, nazywamy też niezgodnością pyłku. U niektórych roślin występuje niezgodność wewnątrzgatunkowa (samoniezgodność) - zjawisko, które jest przyczyną obligatoryjnej obcopylności. Różne odmiany tego samego gatunku rośliny mogą się różnić występowaniem wspomnianych barier krzyżowania. Na przykład u rzepaku niektóre genotypy są samoniezgodne (czyli nie tworzą nasion w wyniku samozapylenia, albo tworzą ich bardzo mało), inne linie są samozgodne (samozapylenie prowadzi do wytworzenia nasion).

Pokonywanie przedzygotycznych barier krzyżowania nie zawsze wymaga uciekania się do hodowli in vitro, niemniej kultury in vitro często są w tym celu wykorzystywane. W razie trudności w pobieraniu przez pyłek wody ze znamienia słupka, korzystne może okazać się zapylanie w atmosferze o wysokiej wilgotności. Przyczyną trudności obcego pyłku w kiełkowaniu na znamieniu słupka może być jego niezdolność do tworzenia i uwalniania białek charakterystycznych dla pyłku zgodnego, warunkujących rozpoznanie pyłku przez znamię słupka. W takim przypadku rozwiązaniem może być zastosowanie "pyłku przewodnika" (ang. mentor pollen), tzn. zastosowanie mieszaniny pyłku - oprócz niezgodnego, dodawany jest pyłek zgodny (naturalnie kiełkujący) który został wcześniej unieczynniony (w wyniku naświetlania promieniami UV, zamrożenia i ogrzania lub traktowania metanolem) tak że jest on źródłem odpowiednich białek, ale sam nie może kiełkować, albo kiełkuje, ale nie uczestniczy w zapłodnieniu. Podejmowano również próby zastępowania "pyłku przewodnika" roztworem ekstrahowanych z niego białek, w którym zawieszano pyłek niezgodny, a także przemywania znamion słupka gorącą wodą lub rozpuszczalnikami organicznymi (heksan, octan etylu) w celu pozbawienia ich zdolności do wybiórczego rozpoznawania pyłku. We wszystkich powyższych doświadczeniach wykorzystywano słupki kwiatów, pozostawione na roślinie (in vivo) lub odcięte i hodowane in vitro. Ponieważ zdolność do rozpoznania zgodnego pyłku mają głównie komórki znamienia, krzyżowanie roślin może być łatwiejsze gdy znamię słupka zostanie usunięte, a pyłek naniesiony na przeciętą szyjkę słupka lub wprost do zalążni (mówi się wtedy o zapyleniu wewnątrzzalążniowym). Sporadycznie opisywano też przeszczepianie szyjki słupka (wraz ze znamieniem i kiełkującym na nim pyłkiem) - po około dobie od zapylenia, szyjkę słupka odcinano tuż ponad zalążnią i mocowano (odrobiną agaru) do zalążni podobnie przeciętego słupka innej rośliny. Wyłącznie w warunkach in vitro może się udać zapylenie zalążków (uwolnionych z zalążni). Okazuje się jednak, że zalążki niektórych roślin dużo lepiej się rozwijają (tworząc nasiona), gdy z pożywką stykają się nie bezpośrednio, ale za pomocą łożyska - fragmentu zalążni, do którego zalążki przyrośnięte są wyrostkami zwanymi sznureczkiem i z którego pobierają substancje odżywcze. Zapylenie tak hodowanych zalążków nazywane jest zapyleniem placentowym (łożyskowym; łożysko = placenta). Metodą, która bardzo skutecznie wymusza połączenie gamet krzyżowanych roślin jest fuzjonowanie ich protoplastów. Wymaga to izolowania nie samych zalążków i ziaren pyłku, ale tworzących się wewnątrz nich gamet, które następnie trzeba pozbawić ściany komórkowej i poddać działaniu czynników destabilizujących błonę komórkową, a tym samym sprzyjających zlewaniu, łączeniu się (a mówiąc jeszcze bardziej fachowo - fuzjonowaniu) komórek. Ta technika stosowana jest jednak najczęściej do łączenia (fuzjonowania) protoplastów komórek somatycznych i dokładniej przedstawiona jest w Rozdziale 4.

Bariery pozygotyczne krzyżowalności roślin polegają na tym, że do zapłodnienia wprawdzie dochodzi i powstaje zygota, ale tworzący się z niej zarodek mieszańcowy albo wkrótce zamiera (z powodu niedorozwoju bielma i niedożywienia zarodka), albo przekształca się w roślinę o normalnie wprawdzie rozwiniętych organach wegetatywnych lecz bezpłodną (jest to swego rodzaju roślinny odpowiednik muła). Zdarza się też, że pierwsze pokolenie roślin mieszańcowych jest płodne, ale w dalszych pokoleniach zaznacza się degeneracja (zaburzenia rozwojowe) lub bezpłodność.

Metodą, która może pozwolić na pokonanie pozygotycznych barier krzyżowania, objawiających się zaburzeniami embriogenezy jest hodowla in vitro izolowanych zarodków. Izoluje się je gdy są jeszcze na wczesnym etapie rozwoju (zarodki sercowate) i hoduje się je na pożywce zastępującej prawidłowo wykształcone bielmo. Opisano też przeszczepianie zarodków mieszańcowych do hodowanego in vitro bielma izolowanego z zalążków poddanych zapyleniu pyłkiem zgodnym (i dzięki temu zawierających dobrze rozwinięte bielmo). Oczywiście, w takim przypadku zarodek będący wynikiem zapylenia pyłkiem zgodnym jest najpierw usuwany z bielma i zastępowany właśnie zarodkiem mieszańcowym. W przypadku gdy zarodki są bardzo drobne i trudne do izolowania, wystarczającym rozwiązaniem może okazać się hodowla zalążków izolowanych z zapylonych kwiatów, lub skrawków zalążni zawierających takie zalążki. Ponieważ podczas hodowli zalążki i zarodki powiększają się, a ich wymagania pokarmowe stają się coraz prostsze, czasami zaczyna się doświadczenie od hodowli in vitro zalążni (z zapylonych kwiatów), po pewnym czasie przechodzi się do hodowli zalążków, a później do hodowli izolowanych zarodków. Powyższe metody pozwalają na uratowanie mieszańcowych zarodków przed obumieraniem (zwanym aborcją) i stąd bywają ogólnie określane mianem techniki ratowania zarodków (ang. embryo rescue). Technika ta stosowana jest już od kilkudziesięciu lat i pozwoliła otrzymać mieszańce np. różnych gatunków lnu, koniczyny, ogórka, słonecznika, roślin kapustnych, lilii, tulipanów i innych.

Metody zapylenia in vitro oraz ratowania zarodków wymagają od eksperymentatora szczegółowej znajomości dynamiki procesów zapylenia i zapłodnienia u danego gatunku i dobrania najlepszego momentu do przeprowadzenia zabiegu. Na przykład w próbach krzyżowania międzygatunkowego lilii stwierdzono, że najkorzystniej jest hodować in vitro zalążki przez 30 - 45 dni po zapyleniu, by później hodować ich skrawki, albo izolowane zarodki.

Szanse na to, że otrzymane mieszańce będą płodne, można częściowo ocenić biorąc pod uwagę liczbę chromosomów w komórkach obu krzyżowanych roślin. Wiadomo, że z reguły obie gamety przekazują potomstwu cały swój zestaw chromosomów, a więc komórki somatyczne mieszańca mają liczbę 2n równą sumie liczb chromosomów obu gamet, które rozpatrywanej roślinie dały początek. Na przykład krzyżując koniczynę białą (Trifolium repens) o 2n = 32 z koniczyną czerwoną (T. pratense) o 2n = 14 musimy oczekiwać, że mieszaniec będzie miał w komórkach somatycznych 2n = 23 chromosomy (16 pochodzących od T. repens i 7 od T. pratense). Najprawdopodobniej będzie więc bezpłodny, bo nie da się 23 chromosomów podzielić na dwa równe zestawy i przekazać tworzącym się gametom. U takiego mieszańca w gametogenezie wystąpią zaburzenia, które najprawdopodobniej spowodują jego bezpłodność. Czy tak jest w istocie, rozstrzygnąć musi jednak doświadczenie, bo przyroda ożywiona nie trzyma się zbyt sztywno swych praw. Bezpłodność mieszańców jest, jak już wspomniano, barierą krzyżowalności typu pozygotycznego. Sposobem na jej pokonanie może być podwojenie liczby chromosomów u mieszańca. W naszym przykładzie mieszaniec, zawierający początkowo 2n = 2x = 23 chromosomów w wyniku tego zabiegu zawierałby 2n = 4x = 46 chromosomów (symbol 2n stosujemy tu, bo nadal dla "aparatu mejotycznego" komórek jest to zestaw, który należy podzielić na dwie połowy; symbolem 4x zaznaczamy, że występujące tam chromosomy mogłyby utworzyć cztery autonomiczne, w pełni funkcjonalne, genomy komórek haploidalnych; ten zapis przypomina nam, że rozpatrywany organizm jest tetraploidem, a dokładniej allotetraploidem, bo jego genom zawiera zestawy chromosomów pochodzące z różnych gatunków).

Podwojenie liczby chromosomów zachodzi czasem spontanicznie (zwłaszcza w kulturach in vitro), ale w praktyce wywołuje się je sztucznie, poddając rośliny (młode, dobrze rozwinięte siewki lub wierzchołki pędów) przez kilka godzin działaniu mutagenów (czas powinien być tak dobrany, żeby nie przekraczał długości cyklu komórkowego). Takim najczęściej stosowanym mutagenem zaburzającym kariokinezę (podział materiału jądrowego), jest protoalkaloid kolchicyna (z zimowita jesiennego Colchicum autumnale), rzadziej oryzalina. Sporadycznie wspomina się też o możliwości zastosowania do tego celu podtlenku azotu. Ponieważ skuteczność czynników podwajających genom nie jest stuprocentowa, konieczne jest sprawdzenie stopnia ploidalności komórek regenerowanych roślin. Wstępnie można o nim wnioskować na podstawie takich parametrów pomocniczych jak wielkość ziaren pyłku, długość aparatów szparkowych lub liczba chloroplastów w komórkach szparkowych. Dokładniejszej oceny dokonuje się licząc chromosomy na mikroskopowych preparatach merystemów, albo wykorzystując metodę cytometrii przepływowej, omówioną w dalszej części skryptu.