| Start | Informacje | Spis treści | Słownik | Przydatne adresy |

2.4 Uwalnianie roślin od patogenów przy pomocy kultur in vitro

Do uwalniania roślin od szczególnie uporczywych patogenów stosuje się głównie hodowle merystemów wierzchołkowych pędów. Używając tego terminu, mamy na myśli bardzo drobne eksplantaty, wielkości 0,2 – 3 mm, zwykle poniżej 1 mm, zawierające tylko merystem wierzchołkowy pędu i ewentualnie kilka najmłodszych zawiązków liściowych. W przypadku większych eksplantatów, wyraźnie widocznych gołym okiem mówilibyśmy po prostu o hodowlach wierzchołków pędów. Jak wspomniano wyżej, hodowle wierzchołków pędów prowadzone są często jako forma mikrorozmnażania roślin, natomiast powodem do prowadzenia hodowli merystemów wierzchołkowych pędów (bardziej kłopotliwych i trudniejszych do założenia) jest fakt, że merystemy te zwykle nie zawierają wirusów i innych fitopatogenów, i to nawet wtedy gdy patogeny te opanowały już pozostałe tkanki rośliny. Może się też zdarzyć, że merystemy wierzchołkowe zawierają niewielkie ilości patogenów i pozbywają się ich podczas kultury. Dlaczego tak jest, dokładnie nie wiadomo. Jako przyczyny rozważa się: a.) utrudnione przenikanie wirusów do części roślin nie zawierających wykształconych tkanek przewodzących, b.)wysoką aktywność podziałową tkanek co może utrudniać syntezę RNA niezbędnego dla rozmnażania wirusa, c.) być może jakieś czynniki chemiczne hamujące rozmnażanie wirusów (wysoka zawartość auksyn?), d.) zjawisko wyciszania wirusowych genów, tak zwanej interferencji RNA (RNAi). Na znaczenie tego ostatniego zjawiska wskazuje fakt, że te nieliczne wirusy, które rozwijają się w merystemach wierzchołkowych, wytwarzają białka będące supresorami RNAi, większość natomiast wirusów nie tworzy takich białek i nie jest w stanie namnażać się w merystemach. W każdym razie ze względu na wspomnianą właściwość hodowle merystemów wierzchołkowych pędów bywają stosowane do uwalniania roślin od wirusów. Możliwe, choć rzadziej stosowane jest wykorzystanie takich hodowli do uwalniania roślin także od mykoplazm, grzybów i bakterii (chodzi tu zwalczanie zakażeń układowych, czyli wywoływanych przez patogeny bytujące wewnątrz komórek lub w przestworach międzykomórkowych, a nie na powierzchni organów roślinnych; usuwanie drobnoustrojów występujących na powierzchni roślin jest łatwiejsze i służą do tego metody odkażania materiału roślinnego opisane w rozdziale 1.3).

Wierzchołkowy odcinek pędu umieszcza się w dobrze oświetlonym polu widzenia binokularu (mikroskopu stereoskopowego) i usuwa się najstarsze (najbardziej zewnętrzne) zawiązki liści lub łuski przy użyciu pierwszej pary igieł (lub skalpela i pincety). Następnie nowymi sterylnymi igłami (albo ponownie odkażonymi igłami) zdejmuje się zawiązki młodszych liści i stopniowo odsłania się merystem wierzchołkowy pędu, na którym mogą jeszcze pozostawać zawiązki pierwszej pary liści. Zależnie od kształtu merystemu, odcina się go od pędu jednym cięciem, lub gdy tworzy silnie zagłębioną czaszę – cięciem prowadzonym w dwóch płaszczyznach. Zaleca się możliwie szybką pracę, aby uniknąć zwiędnięcia wrażliwych na wysychanie tkanek merystematycznych. Uszkodzenie merystemu powoduje nadmierny wzrost korzeni, a słabe wydłużanie się pędu, albo kalusowanie zamiast regeneracji. Podobnie niekorzystne jest pozostawienie zbyt dużego fragmentu merystematycznych tkanek pędu – przede wszystkim zmniejsza szanse na eliminację patogenu, ale może też powodować nadmierne kalusowanie eksplatatów, słabe ukorzenianie się wierzchołków i zaburzenia w ich rozwoju.

Hodowle merystemów bywają łączone z innymi metodami zwalczania roślinnych wirusów – termoterapią, chemioterapią, krioterapią, czy nawet – sporadycznie opisywaną – elektroterapią. Termoterapia to traktowanie roślin podwyższoną temperaturą (32 – 40°C) przez kilka dni do kilku miesięcy. Podane warunki można uznać za typowe, czy wyjściowe do doświadczeń, ale opisywano również skuteczne zastosowanie innych form termoterapii. Na przykład do uwalniania tytoniu od wirusa mozaiki ogórka (mającego wbrew nazwie bardzo szeroki zakres pagoteniczności) zastosowano hodowlę w naprzemiennej temperaturze: 40°C przez 16 godzin i 22°C przez 8 godzin, w cyklach powtarzanych przez 12 dni. Uzyskano w ten sposób lepszą przeżywalność eksplantatów. Hodowle drobnych eksplantatów, raczej niż całych roślin, można poddawać działaniu wyższej temperatury (np. 50 – 52°C ale przez 10 – 30 min). Termoterapii można poddawać również nasiona mocząc je w gorącej wodzie (35 – 54°C) przez kilka minut do kilku godzin.

Mechanizm działania termoterapii nie jest pewny. To samo zresztą dotyczy krioterapii – rzadziej wykorzystywanej metody uwalniania roślin od patogenów przez poddawanie ich fragmentów głębokiemu zamrożeniu (w ciekłym azocie). Oczywiście, przed zamrożeniem fragmenty roślin muszą być odpowiednio przygotowane przy pomocy krioprotektantów, tak jak to opisano w rozdziale poświęconym krioprezerwacji (Rozdz. 2.3); po rozmrożeniu materiału pobierane są z niego eksplantaty i na odpowiednich pożywkach regenerowane rośliny.

W chemioterapii (ang. chemotherapy) wykorzystuje się analogi roślinnych metabolitów, zwane antymetabolitami (substancje przypominające naturalne produkty przemiany materii, zwłaszcza nukleotydy, ale nieco się od nich różniące; wirusy czasami tej drobnej różnicy „nie zauważają”, na swoją zgubę – antymetabolity zakłócają cykl rozwojowy wirusów, głównie przez wbudowywanie się do ich genomów). Są to na przykład: tiouracyl, bromouracyl, a także 2,4-D (przypominamy, że jest to syntetyczna auksyna; może być też stosowany jako chemioterapeutyk roślin, ale wymagane jest wtedy dużo wyższe stężenie, np. 2000 mg/l w porównaniu z ułamkiem mg/l do kilku mg/l gdy 2,4-D ma działać jako auksyna). Antymetabolity mogą być stosowane do podlewania lub opryskiwania roślin, albo dodawane do pożywek do hodowli in vitro. Stosunkowo skutecznym środkiem dodawanym do pożywki okazał się związek zwany rybawiryną (ribavirin) lub virazolem (1-?-D-rybofuranozylo-1-2-4-triazolo-3 carboksyamid), który jest syntetycznym analogiem guanozyny, stosowanym sporadycznie również w leczeniu wirusowych chorób ludzi ( http://en.wikipedia.org/wiki/Ribavirin ). Zastosowano rybawirynę np. do leczenia roślin z mozaiki ogórka (powodowanej przez wirusa CMV), dodając ją do pożywki w stężeniu do 100 mg/l i hodując rośliny przez okres do 127 dni. Opisano także uwalnianie roślin (m.in. ziemniaków) od wirusów przy pomocy zieleni malachitowej (czyli zieleni anilinowej http://en.wikipedia.org/wiki/Malachite_green ), barwnika wykazującego także działanie przeciwgrzybowe i stosowanego częściej w terapii ryb.

Elektroterapia to wykorzystanie impulsów pola elektrycznego do leczenia chorób wirusowych. Metoda została opatentowana na Kubie. Odcinki pędów długości 2-3 cm, zawierające merystemy wierzchołkowe, płucze się przez 5 min w roztworze detergentu, a następnie przenosi do roztworu NaCl i poddaje działaniu prądu o napięciu 15V przez 5 min. Następnie materiał odkaża się płucząc w 70% etanolu i 3% podchlorynie sodu. Izoluje się merystemy i przenosi na pożywkę MS w celu regeneracji roślin. Uzyskano w ten sposób wolne od wirusów rośliny cebuli, ziemniaka, trzciny cukrowej i banana. Późniejsze analizy potwierdzały, że około 40– 80% regenerujących roślin nie zawierało patogenu. Patogeny różnią się wrażliwością na poszczególne zabiegi terapeutyczne, np. PRLV (wirus liściozwoju ziemniaka) jest bardzo wrażliwy na wysoką temperaturę; termoterapia jest stosunkowo nieskuteczna w przypadku PSTVd (wiroida wrzecionowatości bulw ziemniaka; wiroid jest wirusopodobnym czynnikiem zakaźnym, w odróżnieniu od wirusów nie zawiera jednak białek, a jedynie materiał genetyczny, w tym przypadku jednoniciowe RNA o długości 359 nukleotydów). Za dość skuteczną metodę zwalczania PSTVd uważa się natomiast krioterapię.

Po zastosowaniu któregokolwiek z powyższych zabiegów (na ogół łączy się merystemowanie z jedną z pozostałych metod) konieczne jest sprawdzanie skuteczności uwalniania roślin od wirusów. Wykorzystuje się do tego następujące metody:

1. traktowanie sokiem badanych roślin liści roślin wskaźnikowych (charakteryzujących się wyraźną, charakterystyczną reakcją na danego wirusa)
2. metody mikroskopowe: a) mikroskop optyczny do wykrywania ciał wtrętowych (=inkluzyjnych) to jest skupisk wielu cząstek wirusowych (wirionów) zlepionych białkiem; b.) mikroskop elektronowy do obserwacji pojedynczych wirionów
3. analizy biochemiczne i immunochemiczne – PCR (reakcja łańcuchowa polimerazy DNA), RT-PCR (odwrotna transkrypcja + PCR), ELISA (test immunoenzymatyczny, analiza, w której sprawdza się obecność w badanym płynie – np. ekstrakcie roślinnym – cząstek wirusowych rozpoznawanych przez przeciwciała – białka wykorzystywane tu jako wysoce wybiórczy odczynnik; wykrycie przez przeciwciała ich charakterystycznych cząsteczek docelowych zapoczątkowuje reakcję enzymatyczną, której produkt daje się łatwo wykryć).

Hodowle izolowanych merystemów mają duże znaczenie w uprawie roślin ozdobnych gerbery, lilii , goździka, pelargonii, a także w przygotowaniu materiału rozmnożeniowego ziemniaków.

O ile wierzchołki pędu (eksplantaty wielkości kilku mm do kilku cm) mogą zwykle rozwijać się na pożywkach nie zawierających fitohormonów, o tyle izolowane merystemy wierzchołkowe wymagają w pożywce auksyn, np. NAA, IAA, rzadziej IBA.

U dość nielicznych roślin, np. storczyków, truskawek, izolacja merystemów wierzchołkowych pędów zachodzi stosunkowo łatwo, a namnażanie z nich pędów zachodzi bardzo wydajnie, więc hodowle merystemów znajdują zastosowanie zarówno do uwalniania roślin od wirusów (czy upewnienia się że produkowane rośliny są wolne od wirusów) jak i mikrorozmnażania. Metodę hodowli merystemów pędów służącą obu tym celom nazywa się czasem meryklonowaniem.