3.2.3 Etapy procesu krioprezerwacji
- przygotowanie materiału biologicznego – komórki lub organy inkubuje się na zmodyfikowanych pożywkach i w zmodyfikowanych warunkach fizycznych; ewentualnie poddaje się je też kapsułkowaniu w kulkach z żelu alginianowego z dodatkiem soli mineralnych i sacharozy; obniża się temperaturę, intensywność światła, modyfikuje się stężenie sacharozy i regulatorów wzrostu w pożywce lub uzupełnia się pożywkę o krioprotektanty (takie jak mannitol, sorbitol czy DMSO) w niskim stężeniu;
- dodanie zasadniczego krioprotektanta/krioprotektantów do końcowego stężenia i zamrażanie materiału – stopniowe ochładzanie (w tempie około 0,2-1°C/min) lub bezpośrednie umieszczenie materiału w temperaturze ciekłego azotu;
- przechowywanie materiału w ciekłym azocie lub jego oparach;
- rozmrażanie – aby zapobiec powiększaniu się kryształów lodu wewnątrz komórki i tym samym destrukcji materiału (przy powolnym rozmrażaniu), próby umieszcza się bezpośrednio w łaźni wodnej o temperaturze 34-40°C;
- usunięcie krioprotektanta (odmycie); ewentualnie usunięcie żelowych kapsułek otaczających materiał (o ile zostały zastosowane)
- rekultura – zwykle od 1 dnia do 1 tygodnia – podczas tego okresu kultura wymaga czasami modyfikacji pożywki oraz zmiany rodzaju albo stężenia hormonów w celu „odzyskania” przez komórki ich pierwotnego wigoru, utrzymania żywotności i zainicjowania wzrostu;
- regeneracja roślin.
Ważne jest dobranie odpowiedniej fazy wzrostu kultury poddawanej krioprezerwacji, ponieważ wpływa ona na przeżywalność komórek. W przypadku marchwi do zamrażania pobiera się komórki piątego dnia po przeszczepianiu, kiedy obserwowane jest maksymalne natężenie podziałów, a komórki znajdują się na początku logarytmicznej fazy wzrostu. Niektórzy badacze za najbardziej odpowiednią do rozpoczęcia krioprezerwacji uważają końcowy etap logarytmicznej (czy, mówiąc inaczej – wykładniczej) fazy wzrostu komórek.