| Start | Informacje | Spis treści | Słownik | Przydatne adresy |

3.2.2 Zasady krioprezerwacji

Krioprezerwacji poddaje się komórki wszystkich organizmów. Istotnymi pod tym względem wyróżnikami komórek roślinnych są ich znaczne rozmiary, silna wakuolizacja oraz wysoki stopień uwodnienia. Oczywiście, cechy te sprawiają, że komórki roślinne nieco trudniej jest poddać krioprezerwacji, niż komórki innych organizmów, a zwłaszcza drobnoustrojów. Nieostrożne zamrażanie komórek powoduje dwa rodzaje problemów: 1.) tworzenie się wewnątrzkomórkowych kryształów, rozrywających błony komórkowe; 2.) gwałtowne odwadnianie komórek przez powiększające się kryształy lodu, także te, które tworzą się zewnątrzkomórkowo; narusza to strukturę makrocząsteczek - kwasów nukleinowych i białek.

Niektóre gatunki znacznie lepiej znoszą zamrażanie niż inne. Istnieje więc uwarunkowana genetycznie odporność niektórych roślin na mróz. Rośliny takie wytwarzają pod wpływem obniżających się temperatur różne metabolity, podwyższające ich przeżywalność. Substancje chroniące komórki i tkanki przed uszkodzeniem wskutek zamrażania nazywamy krioprotektantami. Przed poddaniem dowolnych komórek głębokiemu zamrożeniu, inkubuje się je w roztworze dodatkowych krioprotektantów (wyjątkowo tkanki ulegające naturalnie silnemu odwodnieniu, zwłaszcza nasiona, mogą dobrze znosić stan głębokiego zamrożenia nawet bez potraktowania dodatkowymi krioprotektantami).

Wyróżnia się dwa rodzaje krioprotektantów:

1. wnikające do komórki – DMSO (dimetylosulfotlenek), glicerol, glikol propylenowy; związki te chronią komórki od wewnątrz, jednak zastosowane w zbyt wysokich stężeniach wywołują zatrucie komórek;
2. nie przenikające łatwo przez błony komórkowe – cukry, wysokocząsteczkowe alkohole, glikol polietylenowy, dekstran - związki te chronią komórki od zewnątrz, jednak zastosowane w zbyt wysokich stężeniach mogą naruszać równowagę osmotyczną komórki.

Wspomniane wyżej typowe krioprotektanty działają obniżając potencjał wodny komórek. Znaczenie ochronne mogą mieć także inne substancje, o działaniu bardziej pośrednim, np. kwas abscysynowy (ABA) dodany do pożywki pobudza w komórkach ekspresję genów warunkujących odporność na stresy abiotyczne. Odporność komórek na mrożenie mogą podwyższać także aminokwasy, a przede wszystkim prolina, walina, glicyna i tyrozyna, które wpływają stabilizująco na białka enzymatyczne i białka błon komórkowych.

Do krioprezerwacji większości obiektów biologicznych wykorzystuje się zwykle jeden, optymalny krioprotektant (np. dla bakterii, bakteriofagów i grzybów zaleca się 10% glicerol (czyli roztwór ok. 1M), dla komórek ssaków glicerol albo DMSO o stężeniu – w obu wypadkach – 5 do 10%, dla glonów metanol lub DMSO o stężeniu – w obu wypadkach – 5 do 10% (czyli o stężeniu ok. 0,64 M do 1,28 M). Wyjątkowo do utrwalania obiektów roślinnych wykorzystywane są często zestawy kilku krioprotektantów, np. gliceryna + DMSO (w obu wypadkach o stężeniu 5 – 10%; zwraca się uwagę, że powinny to być odczynnikI o możliwie najwyższym stopniu czystości; glicerynę poddaje się autoklawowaniu; DMSO odkażany jest przez filtrację, jakkolwiek wymaga to pewnej ostrożności w doborze filtra – niektóre mogą być rozpuszczane przez DMSO). Dodajmy dla uzupełnienia, że wirusy (zarówno roślinne jak i zwierzęce) można z dobrym skutkiem zamrażać bez użycia krioprotektantów.