| Start | Informacje | Spis treści | Słownik | Przydatne adresy |

3. Historia opracowania pożywki B5 Gamborga (1968)¹

Pożywka ta była pierwotnie przeznaczona do prowadzenia hodowli zawiesinowych komórek korzeni soi, ale współcześnie jest wśród „hodowców”² roślinnych tkanek niemal tak popularna jak pożywka MS i wykorzystuje się ją zarówno stanie płynnym, jak i zestaloną agarem. Jako pracę źródłową opisującą zestaw B5 Gamborga przytacza się publikację w Experimental Cell Research, z 1968 r., ale można się z niej głównie dowiedzieć, że B5 jest uproszczoną wersją pożywki PRL-4C Gamborga, w której pominięto hydrolizat kazeiny (N-Z amine), uznając że jest on z powodzeniem zastępowany przez siarczan amonu (1 mM)³. Okazało się, że jest to lepsze źródło zredukowanego azotu, niż wspomniana złożona mieszanina o niejednoznacznie określonym składzie chemicznym, a także w porównaniu z glutaminą (1 – 8 mM), która także może tę mieszaninę zastąpić. Stwierdzono, że jony amonowe działały toksycznie na komórki soi przy stężeniu powyżej 2 mM (obserwowano wtedy hamowanie niektórych enzymów cyklu Krebsa). Za odpowiednie stężenia azotanów uznano wartości z zakresu 20 – 30 mM, jakkolwiek na przedstawionym przez autorów wykresie widać nieznaczne podwyższenie szybkości wzrostu jeszcze przy ponad 40 mM stężeniu azotanów. Natomiast podwyższenie zawartości sacharozy w pożywce powyżej 20 g/l nie dawało żadnego przyśpieszenia wzrostu hodowli (przyrostów suchej masy komórek). Najodpowiedniejszym początkowym pH pożywki okazały się wartości z zakresu 4,5 – 5,5 (powyżej pH 5,5 szybkość wzrostu hodowli gwałtownie się obniżała). Z charakterystycznego zestawu witamin pożywki B5, wyraźny efekt dawała jedynie tiamina – jej pominięcie powodowało ponad pięciokrotny spadek szybkości wzrostu zawiesiny. Dodatek pozostałych witamin – pirydoksyny, kwas nikotynowego i inozytolu – nie dawał żadnego pobudzenia wzrostu hodowli w porównaniu z pożywką zawierającą tylko tiaminę, najwyraźniej więc pozostawiono je w ostatecznej recepturze „na wszelki wypadek”.

Podsumowując uzyskane wyniki autorzy, stwierdzali: „Przedstawiona pożywka jest zupełnie odpowiednia dla kultur soi. Nie powstają w niej duże agregaty komórkowe, komórki są wyrównane [zapewne pod względem kształtu i wielkości]. Udział komórek pojedynczych w hodowli jest zmienny, ale zawiesinę daje się łatwo pipetować.”

Aby odrobinę dokładniej wyobrazić sobie sposób opracowania przez Gamborga pożywki B5, trzeba zajrzeć do jego wcześniejszej publikacji, wprowadzającej pożywki PRL-4C i PRL4-C-CM, a noszącej nieco zaskakujący tytuł „Metabolizm związków aromatycznych u roślin. Cz. II. Enzymy szlaku szikimianowego w kulturach zawiesinowych roślinnych komórek”⁴. Okazuje się, że pożywki serii PRL-4 były ubocznym efektem badań nad metabolizmem wtórnym komórek różnych typów (pochodzących z korzeni, hypokotyli, łodyg, ogonków liściowych) i różnych gatunków – ziemniaka, róży, rezedy, soi, fasoli, chrzanu, gryki. Pożywka PRL-4C-CM okazała się odpowiednia dla wzrostu komórek wszystkich powyższych roślin i stanowiła kompromis pomiędzy zestawami składników mineralnych z pożywek Hellera (1953) oraz Linsmaiera i Skooga (1965). Opracowując ją odnoszono się także do pożywki White’a, uznając, że należy ją wzbogacić w potas, azotany, fosfor i jony amonowe.

Komórki gryki, chrzanu i fasoli nie namnażały się w płynnej pożywce dopóki nie wzbogacono jej w mleczko kokosowe (ang. coconut milk, stąd CM w symbolu pożywki⁵; pierwsza litera C natomiast nawiązuje do hydrolizatu kazeiny dodawanego do tych pożywek – ang. casein). Komórki innych roślin namnażały się w pożywce syntetycznej, zawierającej zamiast mleczka kokosowego wiele aminokwasów i witamin (PRL-4-DM), jakkolwiek znacznie wolniej niż w PRL-4C-CM. Podstawowy zestaw składników pożywki PRL-4-C uzupełniano odpowiednią auksyną– w zależności od gatunku rośliny – 2,4-D lub NAA (o stężeniu 2 mg/l). Komórki pędów róży i rezedy nie wymagały żadnej auksyny w pożywce. Komórki ziemniaka, zarówno te które hodowano na pożywce z 2,4-D, jak i te które hodowano na pożywce z NAA, były czerwone od obficie nagromadzających się w nich antocyjanów. Gromadziły też kwas chlorogenowy.

Hodowle pasażowano co 4 do 10 dni, przenosząc do 40 ml pożywki inoculum o objętości 4 – 8 ml. W przypadku hodowli ziemniaka, zamiast płynnego inoculum do pasaży używano kilku dużych agregatów komórkowych, które rozdrabniano i przenoszono do nowej pożywki. Uzyskiwano przyrosty suchej masy komórek w zakresie 245 – 1600 mg/dzień/litr pożywki. Autor powołując się na dostępną literaturę zwracał uwagę, że hodowle zawiesinowe komórek mogą wykazywać znacznie wyższą aktywność enzymów metabolizmu wtórnego (np. amoniako-liazy fenyloalaniny).

Pożywki serii PRL-4 zostały dziś praktycznie zupełnie zastąpione zestawem B5, bogatszym w KNO3, i jony fosforanowe, a nieco uboższym (o dziwo!) w siarczan amonu.

Bilanse jonowe pożywek