| Start | Informacje | Spis treści | Słownik | Przydatne adresy |

Ćwiczenie 1

Istota roślinnych kultur in vitro. Zasady pracy w warunkach jałowości.
Zakładanie pierwszych aksenicznych hodowli

W poniższym opisie wyróżniono kolorem opisy czynności, które będą się powtarzać na wielu ćwiczeniach

Zadania
Przygotowanie komory laminarnej
  1. Z komory usunąć wszelkie naczynia (zostawić jedynie słoik z denaturatem), włączyć nawiew (stały przepływ) i lampę UV (jeśli koło komory jest kamera, to najpierw musi być wyłączona i osłonięta); odkażać promieniami UV wnętrze komory przez ok. 20 min
  2. Wyłączyć lampę UV i schować ją pod pokrywą; włączyć białą lampę.
  3. Podwinąć do łokci rękawy fartucha, zdjąć zegarek, ręce starannie natrzeć 50% izopropanolem; spryskać blat komory 50% izopropanolem i przetrzeć papierowym ręcznikiem
  4. W komorze umieścić niezbędne naczynia i materiały, tak by w jak najmniejszym stopniu zakłócać laminarny przepływ powietrza (wyższe przedmioty ustawiać po bokach komory; środkową część komory aż po filtr HEPA zostawić nie zastawioną). Po ustawieniu wszystkich niezbędnych do pracy przedmiotów ponownie przetrzeć ręce alkoholem;
    nie wyciągać rąk z komory; podczas pracy unikać gwałtownych, potrząsających ruchów rąk,
    nie trzymać rąk nad odsłoniętymi jałowymi naczyniami i materiałami;
    nie wkładać głowy do komory laminarnej!
W celu wykonania poniższych zadań należy w komorze umieścić następujące przedmioty:
  • dwa jałowe słoiki puste
  • dwie butelki lub kolby z jałową wodą
  • duży słój na zużyte roztwory
  • roztwór środka odkażającego
  • pojemniki z nasionami koniczyny i grochu (zaparzacze do herbaty)
  • plasterki korzenia marchwi (umyte, oskrobane)
Odkażanie materiału roślinnego
  1. organy podziemne (korzenie, cebule, bulwy) starannie umyć i oskrobać, ewentualnie płukać pod bieżącą wodą przez godzinę; korzenie marchwi pokroić na plasterki grubości ok. 1 cm; nasiona zamknąć w sitku lub pergaminowej torebce
  1. płukać około 20 s w denaturacie
  2. odkażać przez 15 min ok. 1% podchlorynem sodowym (NaOCl; w praktyce 5-krotnie rozcieńczony płyn Ace)
  3. trzykrotnie płukać jałową wodą:     a) 30 s     b) 1 min     c) 3 min
Czynności 3 - 4 muszą być wykonywane w komorze laminarnej, w jałowych naczyniach.

Po zakończeniu odkażania materiału biologicznego usunąć z komory naczynia z zużytymi roztworami; wstawić do komory płytki z bibułą (do wycinania eksplantatów) i naczynia z pożywką
Odkażanie narzędzi Odkażanie narzędzi (przeprowadzamy czekając na odkażenie materiału biologicznego)
W razie potrzeby oczyścić końce pincety czy skalpela ręcznikiem papierowym z resztek roślin i innych zanieczyszczeń. Zanurzyć robocze końce narzędzi w denaturacie, przenieść do elektrycznego sterylizatora i opalać przez minutę (jeśli świeci zielona lampka gotowości sterylizatora do pracy).
Odkładać narzędzia wewnątrz komory do przestygnięcia - opierać na podstawce, albo wieszać na półeczce; robocze powierzchnie narzędzi nie mogą dotykać blatu komory ani innych przedmiotów; umieszczać narzędzia w komorze w taki sposób, aby w biegu powietrza nie znalazły się przed nimi żadne przedmioty mogące być źródłem zakażenia (np. nie odkażona jeszcze pinceta);
jeśli przystępując do właściwej pracy nie jesteśmy pewni czy narzędzia już dostatecznie ostygły, dotknijmy nimi pożywki lub jałowej wody- to sposób na "osłuchowe" stwierdzenie, że narzędzia są zbyt gorące, ale też na ich szybkie ostudzenie.
  1. Założenie aksenicznych hodowli siewek koniczyny perskiej (40 nasion; 1 płytka/osobę), grochu (6 nasion, 1 płytka/osobę)
  1. Założenie hodowli tkanek korzenia spichrzowego marchwi; 2 płytki/osobę, 4 -5 eksplantatów/płytkę (pożywka M)
Wysiew nasion

Odkażone nasiona koniczyny rozłożyć równomiernie na płytce z pożywką (dla ułatwienia skorzystać z szablonu podłożonego pod płytkę)

Odkażone nasiona grochu ułożyć na bibule zwilżonej pożywką

Siewki będą źródłem eksplantatów do właściwych hodowli in vitro (nast. ćwiczenia)

 Pobieranie eksplantatów do hodowli kalusów marchwi

Odkażony wycinek korzenia marchwi położyć na wolnej jałowej płytce Petriego. Posługując się odkażonym skalpelem i pincetą usunąć zewnętrzne tkanki; z wewnętrznej warstwy o grubości 0,5 cm wycinać trójkąty o boku ok. 0,5 - 1 cm, obejmujące drewno, kambium i łyko. Eksplantaty płasko położyć na pożywce lekko je w nią wciskając, rozmieścić na płytce równomiernie, w możliwie dużej odległości jeden od drugiego.

Ryc. Budowa wtórna korzenia spichrzowego marchwi.
1.) korek, 2.) felogen, 3.) feloderma (tkanka miękiszowa gromadząca materiały zapasowe, tworzona przez felogen, 4.) pozostałości łyka pierwotnego, 5.) łyko wtórne, 6.) kambium, 7.) drewno wtórne, 8.) pozostałości drewna pierwotnego
WSZYSTKIE HODOWLE OPISYWAĆ DATĄ, NR. GRUPY, NR. OSOBY
Hodowle będą prowadzone w 24°C (koniczyna na świetle, pozostałe w ciemności)

Pożywki
Zastosowanie

etapy hodowli		makroel.mikroel. witaminyamino-
kwasy
(mg/l)		cukier

(g/l)		 regulatory
wzrostu
(mg/l)		dodatki

(mg/l)		pHagar

(g/l)
Akseniczne hodowle siewek koniczyny

odkażone nasiona ŕ siewki

MS

MS

MS

Gly (2)		sacharoza (30)-tarcefo-ksym (antybiotyk) 2005,68
Akseniczne hodowle siewek grochu

odkażone nasiona ŕ siewki		 0,2 x MS0,2 x MS-----5,6-
(hodowle na wilgotnej bibule)
Kalus marchwi z korzenia spichrzowego

wycinki odkażonego korzenia spichrzowego
â
kalus (głównie z kambium)
 MSMSMSGly (3)sacharoza (30)IAA (10)
Kin (1)		-5,68

Zagadnienia do powtórki (przykłady)
Zdefiniuj pojęcia:
eksplantat, anergizacja, habituacja, wzrost niezorganizowany, kalus, różnicowanie, odróżnicowanie komórek, kambium, histogeneza, hodowla akseniczna, auksyna endogenna, antyauksyna, fitotropina, cytokinina mocznikowa, fluridon, retardant, pepton, poliamina

W jaki sposób chronimy kultury in vitro przed zakażeniami?
W jakich warunkach fizycznych prowadzi się roślinne hodowle tkankowe?
Jaki jest skład typowych pożywek do roślinnych czystych kultur i jakie czynniki powodują zmiany tego składu podczas przyrządzania pożywki, jej przechowywania i podczas hodowli?
Ostatnia modyfikacja strony: 2010-10-13 22:00